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Metodica Della Conta Su Piastra Del Lievito Ultima Versione Corretta

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Metodica della conta su piastra del lievito La conta su piastra è uno dei più accurati metodi di conta dei microbi vitali perché si ottiene un indicatore visibile per ogni cellula vitale del campione. La tecnica è stata introdotta da Robert Koch che aveva notato la crescita di colonie sulla superficie di una fetta di patata. In pratica una piccola quantità di una sospensione liquida di microbi viene sparsa sulla superficie di un mezzo nutriente solido, che messo in incubazione permette a ogni cellula, dopo molte fissioni, di sviluppare una colonia visibile. Molti campioni possono contenere tanti microbi che anche una piccola quantità potrebbe contenere più di 30-300 unità formanti colonia. In questo caso il campione deve essere diluito in modo da ottenere come risultato finale circa da 30 a 300 CFU per piastra. L’esercitazione utilizza tutte queste tecniche per stabilire quante CFU sono presenti in un dado di lievito di birra. Le operazioni da eseguire sono: 1. Sospendere un dado di lievito, pesato, in 500 mL di H2O distillata 2. Diluizione di questa sospensione con una sequenza di diluizioni seriali fino a un fattore di diluizione di 10−8 (in campione viene diluito 100 milioni di volte) 3. Inseminare per spatolamento una aliquota della diluizione 10−6 e della diluizione 10−8 su agar nutriente cui è stato aggiunto un 4% di glucosio 4. Incubare a 35 (o 37) C per 48 ore in modo che si sviluppino le colonie 5. Contare tutte le colonie formate e calcolare il numero di CFU nel dado originale. Materiale: Per ogni gruppo: un dado di lievito di birra fresco una beuta da 500 mL con 500 mL di H2O distillata sterile sette piastre con agar nutriente + 4% glucosio quattro provette sterili con coperchio un portaprovette una micropipetta con puntali sterili un beaker per la raccolta dei puntali usati contenente eventualmente liquido disinfettante una spatola di vetro SONO ALLESTITE QUATTRO TIPI DI ZONE DI LAVORO. 1.Zona in cui vengono riempite le provette SOTTO CAPPA A FLUSSO LAMINARE dispenser contenente H2O distillata sterile, preparato per dosare 9.9 mL 2.Zona in cui si preleva la sospensione originale SOTTO CAPPA A FLUSSO LAMINARE beuta con la sospensione originale sotto agitazione micropipetta con puntali sterili la prima delle quattro provette contenente 9,9 mL di H2O distillata sterile contrassegnata con il numero 2 2. Zona in cui si effettuano le diluizioni seriali SUI BANCONI micropipetta da 100-200µ L, con puntali sterili bunsen acceso quattro provette con coperchio contrassegnate con i numeri 4, 6 e 8 contenenti 9,9 mL di H2O distillata sterile contenitore di plastica per i puntali usati contenente eventualmente liquido disinfettante 3. Zona in cui si seminano le piastre SUI BANCONI 1 spatola di vetro (bacchette piegata a “mazza da hockey”): micropipetta da 100-200µ L, e puntali sterili contenitore per i puntali usati contenente eventualmente liquido disinfettante Procedimento 1) Preparare la sospensione del lievito: Pesare un dado di lievito con l’involucro, in zona sterile e sospenderlo in 500 mL di acqua. Mescolare tutto (con agitatore magnetico) per 5-10 minuti. Pesare l’involucro e determinare la massa del lievito sospeso. 2) Preparare le piastre di Petri versando (usando tecnica sterile) il terreno liquido facendolo raffreddare/solidificare parzialmente coperto in zona sterile 3) Costruire una “tabella dati” sul quaderno nella quale annotare il numero della piastra, il campione, il suo fattore di diluizione, l’aliquota messa in piastra, una casella per il numero di CFU su ogni piastra e spazio per i calcoli del numero totale di CFU nel campione originale. 4) Preparare le provette per le diluizioni: Versate 9,9 mL di H2O distillata sterile in ognuna delle quattro provette dotate di coperchio. 5) Etichettate le provette con 2, 4, 6 e 8 (per indicare le diluizioni 10−2, 10−4, 10−6 e 10−8). 6) Fare una diluizione seriale 10−8 della sospensione nel modo seguente, usando una punta di pipetta nuova ogni volta: a) Prelevare 0.1 mL della sospensione di lievito originale e introduceteli nella prima provetta (#2). Agitate bene per mescolare. b) Prelevare 0.1 mL della sospensione della provetta #2 e introduceteli nella provetta #4. Agitate bene per mescolare. c) Prelevare 0.1 mL della sospensione della provetta #4 e introduceteli nella provetta #6. Agitate bene per mescolare.. d) Prelevare 0.1 mL della sospensione della provetta #6 e introduceteli nella provetta #8. Agitate bene per mescolare. e) Etichettare due piastre con agar nutriente +4% glucosio, sul fondo con i seguenti dati: data iniziali del gruppo mL di aliquota seminati (0.1 o 0.2) e fattore di diluizione (10−6 o 10−8 ) tempo e temperatura di incubazione tipo di terreno 7) Spatolare i vostri campioni: Preparare la pipetta per il prelievo di 0.1 mL (o 0.2 mL) della diluizione 10−6 (e 10−8).. Inserire la punta appena sotto la superficie, aspirare l’aliquota e versarla sulla piastra giusta (non toccare la superficie dell’agar), spargere uniformemente per spatolamento. Coprire subito. Flambare opportunamente la spatola di vetro, farla raffreddare in zona sterile. 8) Incubare le piastre capovolte a 37°C per 48 ore. 9) Contare il numero di colonie 10) Rappresentare con un disegno a colori una colonia di lievito
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